芒果苷对高糖状态成骨细胞骨向分化的影响

摘    要：目的：研究芒果苷对高糖状态下MC3T3-E1成骨细胞骨向分化能力的影响。方法：采用低糖培养基(对照组)、高糖培养基(高糖组)和含40µmol/L芒果苷的高糖培养基(高糖+芒果苷组)分别体外培养MC3T3-E1成骨细胞。培养14 d后，茜素红染色法定量分析检测成骨细胞钙盐沉积量，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞成骨相关蛋白碱性磷酸酶(ALP)、骨钙蛋白(OCN)的表达水平。结果：对照组光密度(OD)值、ALP、OCN蛋白表达水平高于高糖组与高糖+芒果苷组，高糖+芒果苷组OD值、ALP、OCN蛋白表达水平高于高糖组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：芒果苷可以促进高糖状态下MC3T3-E1成骨细胞的骨向分化。

关键词：芒果苷;成骨细胞;糖尿病;骨向分化;

糖尿病是以高血糖为特征的常见慢性疾病，会导致身体长期处于炎性状态和多种组织受损。骨代谢异常引发的继发性骨量形成减少、骨质疏松等是糖尿病患者常见的并发症[1]。研究表明，糖尿病引起的骨缺损愈合障碍与成骨细胞的凋亡增加及功能异常有关[2]。因此，改善成骨细胞的骨向分化是促进糖尿病患者骨愈合的关键。

芒果苷又称为芒果素或知母宁，主要提取于漆树科植物芒果、扁桃的树皮、叶片和果实中，百合科植物知母的根状茎、地上茎叶部分[3]。芒果苷具有镇咳、平喘、抗炎、杀菌、抗病毒、抗氧化、抗糖尿病、抗肿瘤、保肝利胆等多种药理作用及天然温和毒性低的优势，使其逐渐成为研究的热点[4]。目前，关于芒果苷治疗糖尿病的研究主要集中在降低血糖及糖尿病肾病等并发症方面，但芒果苷在高糖状态下对成骨细胞各项功能的影响机制尚未完全明确。本实验旨在通过分析高糖状态下芒果苷对成骨细胞骨向分化的影响，进一步探究其促进骨再生修复的作用机制，以期为促进糖尿病患者骨组织愈合临床用药提供理论依据，现报告如下。

材料与方法

小鼠成骨细胞株MC3T3-E1购自上海拜力生物科技有限公司；高糖DMEM培养基(H-DMEM，含4.5 g/L葡萄糖)、低糖DMEM培养基(L-DMEM，含1 g/L葡萄糖)、胎牛血清(FBS)均购自美国赛默飞公司；青链霉素混合液、芒果苷粉末购于美国Sigma-Aldrich公司；EDTA-胰酶、茜素红染色液购自北京索莱宝科技有限公司；碱性磷酸酶(ALP)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；骨钙蛋白(OCN)ELISA试剂盒购自上海研启生物科技有限公司。

方法：小鼠成骨细胞株MC3T3-E1用低糖完全培养基培养作为正常对照组，高糖完全培养基培养作为模拟糖尿病组，放置在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。细胞长至80%时，用于后续实验。茜素红染色及定量分析检测细胞成骨功能，取上述两组细胞，以2×105个/m L密度接种于6孔板；以5×104个细胞每孔的细胞量接种于12孔板。细胞贴壁后，使用成骨诱导培养基替换原培养基，细胞分为对照组(低糖成骨诱导培养基培养)、高糖组(高糖成骨诱导培养基培养)、高糖+芒果苷组(高糖成骨诱导培养基培养+芒果苷40µmol/L)。6孔板中细胞分组成骨诱导培养14 d后，采用茜素红S染色液染色，磷酸缓冲液(PBS)漂洗后，倒置显微镜下观察矿化情况。定量分析检测：使用100 mmol/L氯化十六烷基吡啶溶解矿化结节10 min，吸取100µL每孔溶液至96孔板，通过酶标仪测定570 nm光谱下每组光密度(OD)值，根据获得的OD值按照公式对细胞矿化后的钙盐沉积进行定量分析。12孔板中的细胞分组成骨诱导72 h后，收集每孔中的细胞培养上清液，根据ELISA试剂盒使用说明步骤，测定细胞上清液中ALP、OCN的浓度。加入终止液及显色剂15 min以内检测450 nm光谱下各组OD值。按照公式计算各组细胞上清液中ALP、OCN表达量。每组实验重复3次。

统计学分析：使用SPSS 23.0统计分析软件进行数据分析，计量资料以x±s表示，多组采用单因素方差分析(One-way ANOVA)比较，两两之间采用LSD-t检验比较；P<0.05为差异有统计学意义。

结果

三组OD值、ALP、OCN表达水平比较：对照组OD值、ALP、OCN表达水平高于高糖组与高糖+芒果苷组，高糖+芒果苷组OD值、ALP、OCN表达水平高于高糖组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 三组OD值、ALP、OCN表达水平比较

讨论

影响糖尿病患者发生骨愈合障碍的因素十分复杂，高糖作用下的骨代谢失衡是直接原因。成骨细胞是直接影响骨组织生成的重要功能细胞，其主要作用是合成、分泌和矿化骨基质，调节骨代谢过程，其增殖、凋亡及功能障碍是产生骨代谢异常的主要机制[5,6]。MC3T3-E1细胞系是较好的研究体外成骨分化的模型。

高浓度葡萄糖可以诱导MC3T3-E1成骨细胞内氧化应激失衡和活性氧释放、线粒体损伤及自噬，不仅影响其增殖降低、凋亡增加；还会降低细胞矿化水平和成骨标志分子ALP m RNA表达，抑制细胞的骨向分化[7]。高糖环境下的细胞凋亡，可明显促进MC3T3-E1细胞内NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)的表达，引起白细胞介素-18(IL-18)和IL-1β等促炎因子的大量分泌，ALP活性降低，从而引起细胞持续炎性状态和分化能力下降[8]。体外模拟的高糖状态不仅能显著抑制细胞增殖、降低ALP活性，减少矿化结节的形成，还能使细胞骨架的排列伸展受到明显的抑制，细胞骨架本质是蛋白基质，对成骨细胞支撑、维持正常形态，以及在种植体表面结合、附着和伸展有着不可或缺的作用[9]。

芒果苷作为天然的植物提取物，大量研究证实在抗糖尿病方面有着良好的治疗效果。芒果苷干预过氧化氢(H2O2)诱导的成骨细胞氧化应激模型后，能够降低成骨细胞高凋亡率，改善成骨细胞增殖能力，提高细胞内的ALP含量、矿化结节的数量和成骨相关蛋白骨形态发生蛋白2(BMP-2)、骨保护素(OPG)、Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)的表达[10]。

本课题组在先前的实验研究中已证实40µmol/L芒果苷可以显著降低细菌脂多糖诱导的MC3T3-E1细胞内CASP3基因，促进B细胞淋巴瘤-2基因的产生，从而减少成骨细胞凋亡[11]；负载芒果苷的PLGA支架可以改善糖尿病大鼠的牙槽骨缺损情况[12]。本实验进一步验证芒果苷在体外细胞模型中对成骨细胞成骨功能的影响。

在此次实验中，高糖组成骨细胞矿化后的钙盐沉积量与对照组相比明显下降，表明高糖环境抑制成骨细胞矿化能力。相比于高糖组，芒果苷干预后的高糖+芒果苷组，细胞钙盐沉积数量显著增多，提示芒果苷可以改善高糖状态下成骨细胞的矿化能力。

ALP已被证实为成骨细胞的矿化早期标志蛋白，由于其难以准确预测成骨分化晚期的变化，本研究还检测了成骨细胞分化末期的特异性非胶原蛋白OCN。ALP与OCN的表达量高低代表成骨细胞的活跃性。赵强等[13]发现高糖能够通过激活P38 MAPK信号通路，抑制大鼠原代成骨细胞的ALP、OCN表达。本实验中高糖组相比于对照组，ALP与OCN的表达量下降也验证了这一点。另一方面，高糖+芒果苷组与高糖组相比，ALP和OCN的表达显著增加，表明芒果苷可以拮抗高糖状态对成骨细胞的骨向分化抑制作用，有利于最终的骨组织形成。相关研究显示，高糖损害MC3T3-E1细胞糖代谢机制，阻断成骨相关Hedgehog信号通路，抑制骨向分化[14]。关于芒果苷具体通过何种机制抑制成骨细胞的骨向分化还有待以后进一步研究。

随着现代人饮食高糖、高脂化，糖尿病患病率也呈现逐年升高的态势。糖尿病患者并发的骨性疾病也成为人们越来越关注的问题。芒果苷可能有助于糖尿病患者骨组织缺损的再生修复，为后期临床运用芒果苷治疗和改善糖尿病患者骨缺损的再生修复提供理论依据。